Idag har du utfört en PCR.
- Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?
- Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?
- Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?
 |
| Fotografi av gelelktroforesen. |
Översiktligt så ser man till exempel att i den negativa kontrollen, där ett prov helt utan carry over kontamination inte skulle visa något alls att det finns en svag smear, vilket kan vara det som ger en smear även för våran PCR-produkt.
En annan anledning till smear vid PCR-produkten kan vara att primrarna varit ute för länge, eller var gamla och därmed bundit ospecifikt. Vid våran laboration missade vi att göra Mastermixen i ett stort rör, för att sedan pippetera över denna i de rör som skulle gå i PCRen. Detta innebär att våran Mastermix inte var optimerad, vissa rör kan ha fått mer forward primers än reverse primers och vice versa.
Markör IX har en form som jag personligen aldrig sett förut (U-formad) och jag fick höra att det förmodligen berodde på gelen, men då förstår jag inte riktigt varför det bara var just det provet som fick den formen. Jag ska komma ihåg att fråga om det igen.
Vid den positiva kontrollen och PCR-produkten kan man se band som ligger vid samma nivå, bandet vid kontrollen är mycket tjockare vilket indikerar en högre koncentration LL37 än i våran PCR-produkt. Vi kom senare på att vi aldrig kontrollerade om det röret vi tog LL37 var i den koncentrationen som stod i labbkompendiet (5ng) men även så så förväntade vi oss nog ett tjockare band för våran PCR-produkt. Detta kan även det vara kopplat till primrarna.
Jag har svårt att tyda det, men för mig ser det ut som, när jag främst jämför med markör III att genen är precis under markören för 564 bp.
Jag funderar på om det kan vara något som är bristfälligt med markör 9 för vi har lite samma fenomen på vår gelfores. Visserligen är den positiva kontrollen också något böjd men just markör 9 liknar er i det böjda mönstret...
SvaraRaderaJa det var ett par stycken i vår grupp som hade problem med markör nio med, så det verkar konstigt att det skulle vara fel med gelen om bara den brunnen påverkades.
SvaraRaderaDu har en bra diskussion om era resultat.
SvaraRaderaAnledningen till att man har ett så brett intervall (1,6-2) för kvoten på en bra preparation är att absorbansmätningen inte ger så exakt resultat. Jag tror att det delvis beror på att DNA-molekylerna är så stora att fördelningen av dem i lösningen kan påverka absorbansen.
När DNA-molekyler vandrar ojämt i gelen kan det antingen bero på gelen (ojämna brunnar, ej fullständigt löst agaros..), DNA-lösningen (att något finns med i lösningen som påverkar vandringen) eller själva elektroforesen (tex att gelen har blivit varm pga för hög strömstyrka). Om det är samma DNA-praparation som hela tiden vandrar ojämt så är det väl troligast att felet ligger just i den praparationen. men riktigt vad som är orsaken är svårt att säga.
Annica
Hej!
SvaraRaderaJag funderar över hur mycket av Ll37 använde ni ? det verkar vara så att ni hade för lite LL37? kan er master mix ha påverkat ert reslutat också? att ni inte fått en tillräcklig amplifiering?
Jasmin