Dag 4

Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden.

•  Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.
• Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?  
  

Om man jämför gelen efter PCR (från förra inlägget) med membranet som Southern blot resulterade i så är den största skillnaden hur tydligt vi kan se LL37. Vid PCR hade vi en väldigt svag linje för insertet och en lång smear, den positiva kontrollen var tydlig men hade även den en väldigt framträdande smear.

Resultat av Southern blot

På membranet ser vi tydligare linjer, även i väldigt låga koncentrationer som t. ex vid det tunna strecket i mitten som visar insert LL37 i en koncentration på 0,005 µg. På den här bilden syns inte markör IX eller III, utan från vänster till höger har vi klyvd plasmid 0,5 µg, klyvd plasmid 0,005 µg och oklyvd plasmid. På gelen kunde klyvd plasmid i koncentration 0,005 µg knappt urskiljas, här syns den ganska tydligt. 

På gelen kunde vi bara se två band och en svag smear för klyvd plasmid 0,5 µg, här kan vi se band i smearen. Jag är nyfiken på dem, kan bandet som ligger under den klyvda vektorn vara tecken på plasmid som inte klyvts och fortfarande är i supercoiled form? Southern blot skulle då även kunna vara en indikator på hur stegen innan har gått, t. ex då att klyvningen inte var optimal.

Det viktigaste jag lärde mig var att lära mig läsa i förväg. Ibland stirrar man sig blind på det moment som man håller på med just nu och tänker inte på att det t. ex kan stå att bufferten som ska göras på nästa sida för nästa steg ska göras en timme i förväg. Att ta in information runt moment och att multitaska! Jag tyckte det var bra att vi inte hölls i handen under labben utan fick planera och lösa saker ganska självständigt.

Dag 2

Idag har du utfört en PCR.

• Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

• Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?

• Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Fotografi av gelelktroforesen.

På våran gel ser man från vänster till höger: den negativa kontrollen (-, Mastermix + vatten), den positiva kontrollen (+, Mastermix + LL37gen), markör III, oklyvd plasmid, markör IX och våran PCR-produkt.
Översiktligt så ser man till exempel att i den negativa kontrollen, där ett prov helt utan carry over kontamination inte skulle visa något alls att det finns en svag smear, vilket kan vara det som ger en smear även för våran PCR-produkt.

En annan anledning till smear vid PCR-produkten kan vara att primrarna varit ute för länge, eller var gamla och därmed bundit ospecifikt. Vid våran laboration missade vi att göra Mastermixen i ett stort rör, för att sedan pippetera över denna i de rör som skulle gå i PCRen. Detta innebär att våran Mastermix inte var optimerad, vissa rör kan ha fått mer forward primers än reverse primers och vice versa.

Markör IX har en form som jag personligen aldrig sett förut (U-formad) och jag fick höra att det förmodligen berodde på gelen, men då förstår jag inte riktigt varför det bara var just det provet som fick den formen. Jag ska komma ihåg att fråga om det igen.

Vid den positiva kontrollen och PCR-produkten kan man se band som ligger vid samma nivå, bandet vid kontrollen är mycket tjockare vilket indikerar en högre koncentration LL37 än i våran PCR-produkt. Vi kom senare på att vi aldrig kontrollerade om det röret vi tog LL37 var i den koncentrationen som stod i labbkompendiet (5ng) men även så så förväntade vi oss nog ett tjockare band för våran PCR-produkt. Detta kan även det vara kopplat till primrarna.

Jag har svårt att tyda det, men för mig ser det ut som, när jag främst jämför med markör III att genen är precis under markören för 564 bp.

Dag 1

Idag har du renat en rekombinant plasmid från en bakteriesuspension.

• Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?
• Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?
• Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Förhoppningsvis hade vi efter reningen tagit bort proteiner och celldebris, alltså kromosomalt DNA och delar av cellväggen t. ex. Kvoten av A260/A280 blev 1.73 får vårat prov, där ett värde på ca 1.8 hade varit optimalt och kunnat vara en eventuell pekpinne på ett prov med rent DNA.
Vårat värde var inte allt för långt ifrån det, men ett lägre värde än 1.8 brukar indikera proteinföroreningar.

Jag har inga större funderingar kring labben, förutom att jag tyckte det lät udda att ett värde på 1.6 till 2.0 hade varit okej.