Dag 4

Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden.

•  Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.
• Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?  
  

Om man jämför gelen efter PCR (från förra inlägget) med membranet som Southern blot resulterade i så är den största skillnaden hur tydligt vi kan se LL37. Vid PCR hade vi en väldigt svag linje för insertet och en lång smear, den positiva kontrollen var tydlig men hade även den en väldigt framträdande smear.

Resultat av Southern blot

På membranet ser vi tydligare linjer, även i väldigt låga koncentrationer som t. ex vid det tunna strecket i mitten som visar insert LL37 i en koncentration på 0,005 µg. På den här bilden syns inte markör IX eller III, utan från vänster till höger har vi klyvd plasmid 0,5 µg, klyvd plasmid 0,005 µg och oklyvd plasmid. På gelen kunde klyvd plasmid i koncentration 0,005 µg knappt urskiljas, här syns den ganska tydligt. 

På gelen kunde vi bara se två band och en svag smear för klyvd plasmid 0,5 µg, här kan vi se band i smearen. Jag är nyfiken på dem, kan bandet som ligger under den klyvda vektorn vara tecken på plasmid som inte klyvts och fortfarande är i supercoiled form? Southern blot skulle då även kunna vara en indikator på hur stegen innan har gått, t. ex då att klyvningen inte var optimal.

Det viktigaste jag lärde mig var att lära mig läsa i förväg. Ibland stirrar man sig blind på det moment som man håller på med just nu och tänker inte på att det t. ex kan stå att bufferten som ska göras på nästa sida för nästa steg ska göras en timme i förväg. Att ta in information runt moment och att multitaska! Jag tyckte det var bra att vi inte hölls i handen under labben utan fick planera och lösa saker ganska självständigt.